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Microscopie SMLM

par Leveque-Fort Sandrine - 4 août 2015

La microscopie par super-localisation (SMLM Single Molecule Localization Microscopy permet d’atteindre une résolution latérale de l’ordre de 20 nm, grâce à la possibilité d’acquérir à des instants différents l’émission des fluorophores qui se situent dans la fonction réponse du microscope (PSF). Différents acronymes décrivent ces approches de super-localisation par exemple le dSTORM (direct STochastic Optical Reconstruction Microscopy) lorsqu’on utilise des fluorophores organiques ou le PALM lorsqu’on utilise des protéines fluorescentes photoactivables (Photo-Activation Localization Microscopy). L’idée générale dans les deux cas est de n’autoriser dans la PSF qu’un seul fluorophore à être dans un état pouvant conduire à l’émission de fluorescence. Ce fluorophore produit une tache de fluorescence dont la taille est donnée par la limite de diffraction. En revanche, le barycentre de cette tache associée à une molécule unique peut être localisé avec une précision bien supérieure à la limite de diffraction de l’ordre de quelques nanomètres. Il faut répéter ce processus de localisation pour obtenir de façon successive la position de tous les fluorophores présents dans l’echantillon biologique. Dans le cas du dSTORM, afin de permettre la localisation successive de ces molécules uniques, initialement un maximum de fluorophores (type Alexa) sont portés dans un état non fluorescent, et ne reviennent dans l’état fondamental que de façon stochastique, ce qui permet ensuite une observation de la fluorescence de molécules uniques.

Le dispositif réalisé dans le cadre de la thèse de Nicolas Bourg nous permet de réaliser des images multicouleurs (excitation @ 488,561 ou 640 nm)
Un exemple d’image est représenté ci dessous, on voit ainsi qu’en fonction du nombre d’images acquises, la précision de localisation liée au nombre de photons détectés augmente. On peut voir sur l’image finale (6500 acquisitions) que le sous réseau d’actine est ainsi extrêmement bien visible sur l’image dSTORM, alors qu il est flou en épifluorescence.
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