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Accueil > Équipes scientifiques > Biophysique, biophotonique > Super-resolution microscopy and time-resolved imaging > Microscopies au delà de la limite de diffraction > Microscopie de fluorescence supercritique (SAF)

Microscopie de fluorescence supercritique (SAF)

par Leveque-Fort Sandrine - 20 août 2014 (modifié le 3 août 2015)

-Supercritical Angle Fluorescence Microscopy - SAF

L’imagerie supercritique plein champ représente une technique nouvelle de microscopie optique possédant une sélectivité axiale permettant d’accéder à l’observation en temps réel des processus membranaires et d’adhésion. Elle offre de nombreux avantages eus égard aux techniques actuellement proposées commercialement, en particulier la technique de microscopie TIRF (Total Internal Reflection Fluorescence). Elle est basée sur une approche complémentaire, la sélectivité spatiale étant issue non pas d’un confinement à l’excitation mais par une sélectivité à la collection de l’émission de fluorescence de l’échantillon. Ceci présente de nombreux avantages notamment : de baisser significativement le bruit de fond dû à la diffusion intrinsèque de la lumière dans les milieux biologiques, de s’affranchir des difficultés d’éclairage (ce qui offre un champ d’observation plus homogène et un coût de mise en œuvre réduit), et enfin de permettre d’acquérir simultanément et parallèlement une image d’épi-fluorescence standard. Cette technique peut également se coupler avec la plupart des techniques de microscopies existantes.

Les directions d’émission des fluorophores dépendent de leur distance à la surface de la lamelle de verre (cf. fig.). Les fluorophores sont assimilables à des nano-antennes possédant des composantes électromagnétiques évanescentes lorsque leur environnement immédiat est homogène. Par contre, lorsqu’une interface est présente à moins de quelques dizaines de nanomètres, une partie de ces composantes devient propagative. Ce signal est alors émis dans le verre dans des directions au-delà de l’angle critique. Ainsi, alors que l’émission sous-critique est identique quelque soit la distance fluorophore/verre, seuls les fluorophores situés au voisinage immédiat de l’interface possèdent une telle émission supercritique.
Cette lumière parfois désignée sous le nom de " lumière interdite " peut représenter jusqu’à 50% de l’émission vers la lamelle de l’émetteur fluorescent.
Cette emission supercritique decroit très rapidement avec la distance à la surface et permet d’obtenir une localisation axiale nanométrique absolue des fluorophores.
Notre travaillons sur le développement de microscopes plein champ associés à des objectifs à grande ouverture numérique afin de collecter cette emission supercritique. Différents dispositifs permettant d’isoler et/ou mettre en forme les composantes supercritiques ont été réalisés ( Thèse T. Barroca (Institut Langevin ESPCI)), afin de détecter en simultanée l’image d’épifluorescence et l’image membranaire. L’association avec les techniques de super-resolution latérales type STED et SMLM sont en cours.