Microscopie super-résolue tridimensionnelle par modulation du signal de fluorescence de molécules uniques

La microscopie de fluorescence est un outil incontournable fréquemment utilisé en biologie cellulaire de par sa grande spécificité et sa faible toxicité. Les performances des méthodes d’imageries de fluorescence classiques étant limitées par le phénomène de diffraction, de nouvelles approches appelées imageries de super résolution ont vu le jour afin d’outrepasser cette limite et accéder à des informations spatiales jusqu’ici inatteignables en imagerie optique. Plus particulièrement, l’imagerie tridimensionnelle par localisation de molécules uniques (SMLM) permet d’obtenir des résolutions de quelques dizaines de nanomètres rendant cette technique parfaitement adaptée à l’étude des agencements des différentes protéines dans l’échantillon cellulaire. Toutefois, les stratégies de localisations des sondes fluorescentes rencontrent encore certaines limitations liées notamment à une précision axiale non uniforme ou encore une profondeur d’observation souvent limitée au premier micron de l’échantillon.
Nous proposons ici une nouvelle approche de localisation de molécules uniques, appelée ModLoc, qui repose sur la modulation et la démodulation du signal de fluorescence des molécules uniques via l’utilisation d’une excitation structurée et modulée temporellement. Dans un premier temps, nous exposons les fondamentaux de l’imagerie SMLM et les limites actuelles de ce domaine. Les subtilités de ce nouveau principe de localisation sont ensuite détaillées et montrent un gain de précision théorique d’un facteur 3. Des études du caractère temporel aléatoire de l’émission des sondes fluorescentes en imagerie SMLM révèlent la nécessité d’intégrer des solutions optiques rapides (proche du kHz) et innovantes afin de contourner les limites de fréquence d’acquisition imposées par les instruments de détection.).
Dans un second temps, la validation expérimentale du gain en précision accessible est démontrée grâce à la mise en place de deux dispositifs optiques. Nous choisissons d’appliquer ce principe afin d’améliorer la précision de localisation axiale des molécules fluorescentes. Les résultats obtenus mettent en évidence une précision de localisation uniforme de 7.5 nm jusqu’à 7 microns en profondeur sur des échantillons de calibrations et des échantillons biologiques. La robustesse de la méthode pour l’imagerie SMLM en profondeur est également démontrée grâce notamment à des acquisitions effectuées à 30 µm de profondeur dans des milieux aberrants, ce type d’informations n’étant généralement pas accessible en imagerie SMLM 3D.
Pour finir, différentes pistes d’amélioration du dispositif actuel ainsi que l’extension de cette approche de localisation modulée à l’observation d’autres grandeurs telle que le temps de vie et l’orientation des molécules fluorescentes sont proposées.