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Accueil > Équipes scientifiques > Biophysique, biophotonique > Super-resolution microscopy and time-resolved imaging > Microscopie de fluorescence résolue en temps

Microscopie de fluorescence résolue en temps plein champ

par Leveque-Fort Sandrine - 17 août 2015

La microscopie de fluorescence résolue en temps permet d’extraire des informations sur le fluorophore et son environnement. Les images FLIM (pour Fluorescence Lifetime IMaging ) peuvent notamment être révélatrices d’interactions entre protéines, et mettre en évidence un transfert d’énergie de type FRET entre deux molécules très proches (< 10 nm).
Nous avons choisi de mettre en place une stratégie d’acquisition champ large, permettant de sonder simultanément différentes parties de l’échantillon biologique. Ce système est composé d’un intensificateur rapide (HRI, Kentech instrument) qui permet de sélectionner des "fenêtres" d’observation du déclin de fluorescence sur des temps très courts ( entre 100 ps et plusieurs nanosecondes) , et dont la position au cours du temps est ajustée grâce à une ligne à retard. Cet intensificateur est couplé optiquement à une camera CCD, permettant d ’obtenir une série d’images de fluorescence échantillonnant le déclin de fluorescence et ainsi d’extraire le temps de vie pour chaque pixel de l’image (cf figure ci dessous).
Associée à cette approche de détection champ large, trois stratégies d’illumination complémentaires permettant d’obtenir une sélectivité spatiale ont été mises en place :
- le microscope multipoint biphotonique qui bénéficie du confinement inhérent à l’excitation biphotonique, mais également de la parallélisation de l’excitation associée à la détection champ large qui permet une réduction drastique des temps d’acquisition.
- le microscope TIRF (Total Internal Reflection Fluorescence ) : le confinement est obtenu en générant une onde évanescente permettant de spécifiquement observer les membranes cellulaires.
- le microscope sous illumination structurée : la structuration de l’illumination grâce à une matrice de micro-miroirs ( DMD) permet une observation 3D de l’échantillon.

Principe du microscope TIRF résolu en temps